宏韧报告分享 | 生物医药领创者大会2025· 广州大会—AAV和溶瘤病毒类药物生物分析检测策略与案例分享
2025年5月14日-15日，BIOLIGN 2025生物医药领创者大会在广州盛大召开，本次大会以“新质力，新增量”为主题，汇聚了2500+行业精英、800+新药研发单位及150+位顶尖专家.....
图片来源：BIOLIGN会议官方
2025年5月14日-15日，BIOLIGN 2025生物医药领创者大会在广州盛大召开，本次大会以“新质力，新增量”为主题，汇聚了2500+行业精英、800+新药研发单位及150+位顶尖专家，围绕多肽、抗体、XDC、CGT、mRNA&小核酸等创新药的研发与临床研究，干细胞疗法、小分子新靶点新疗法、类器官技术的研发与应用等热门话题展开深度探讨。
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广州宏韧生物医药科技有限公司生物制品生物分析部副总监 庄炜平博士受邀参会，并作了《AAV和溶瘤病毒类药物生物分析检测策略与案例分享》的演讲报告！
报告要点
针对AAV和溶瘤病毒药物的生物分析主要包括：1、PK 、分布和脱落检测。其中，临床由于组织样本取材的限制很难做分布检测。2、免疫原性检测。抗原包括病毒本身和表达蛋白两部分，需进行总抗体ADA 、中和抗体NAb和细胞免疫分析。3. 表达蛋白和细胞因子的检测。需针对AAV 表达蛋白和溶瘤病毒携带的细胞因子进行检测。
01
AAV和溶瘤病毒的PK 、分布和脱落检测
为研究AAV 或溶瘤病毒在体内的暴露情况，需要研究病毒的PK、分布和脱落情况。受限于临床取材的实际情况，临床的组织分布一般不予研究。对于病毒类产品的本身检测的主要分析方法是qPCR/ddPCR；另外，对病毒外源表达蛋白也需要检测，这种蛋白类的分析主要用配体结合实验（LBA）分析外周血或IHC检测组织的蛋白表达情况。
qPCR 分析PK：
制备标准品：AAV和溶瘤病毒的qPCR检测很少用病毒本身当标准品，一般是用质粒。质粒的浓度多为质量浓度，需要根据分子量转换为拷贝数。
引物/探针：引物探针的设计需要涵盖病毒转基因部分，从而防止野生型病毒的假阳性；提取 DNA 要加入 RNA 酶，并对 DNA 提取的质量做鉴定。这样最后测得浓度结果才能准确。
qPCR反应：选择高质量的反应 Mix，TaqMan法进行 PCR 实验。根据标准曲线回算病毒浓度。
对于 qPCR 的分析方法的重要验证项：
标准曲线与定量范围：至少 6 个校正标样建立的曲线应满足 R2≥0.98；扩增效率达 90~110%。
准确度与精密度：PCR 方法的准确度通常较差，常与引物本身的质量和操作的平行性有关，一个好的方法可以做到准确性在 25% 以内。
LLOQ：灵敏度要求做到 50 copies/μg DNA。
提取回收率：基质中加入一定量的病毒进行回收率计算。
病毒脱落检测：
虽然AAV和溶瘤病毒经常被基因改造以限制其致病性 ，但病毒脱落仍然是可能的，应关注此类药物生物安全性风险。
脱落的样本主要包括粪便、尿液、注射部位拭子、鼻咽拭子、唾液、精液等。AAV 脱落只需要使用qPCR 方法检测即可，而溶瘤病毒还需要对qPCR 检测阳性的样本进行病毒感染活力的检测，使用的主要方法为细胞病变法和免疫法。
表达蛋白和相关细胞因子检测：
AAV 转基因蛋白表达是基因治疗发挥功能的前提，需遵循PK 相关指导原则进行方法学的验证。而溶瘤病毒通常携带细胞因子/趋化因子外源基因，能调动免疫系统杀伤肿瘤，可与其他反映免疫系统激活状态的细胞因子，如IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等一起检测。对于多因子的检测，在分析条件需要进行平衡时，应优先偏重于溶瘤病毒携带的细胞因子。
02
AAV和溶瘤病毒的的免疫原性检测
病毒类药物本身包括蛋白和核酸两部分。核酸本身的免疫原性一般不予考虑。蛋白分为病毒本身的衣壳和携带的外源表达蛋白，因而免疫原性需要针对两者进行评估。检测的项目有结合抗体（ADA）、中和抗体和细胞免疫。
表达蛋白免疫原性检测：
表达外源蛋白的免疫原性分析思路与抗体等生物药是一致的。整体来说用多层级的检测方案。即样本首先筛选阳性，阳性的样本再进行确证，最后滴度来相对定量。检测方法最长用的是Bridge ELISA，将外源表达的蛋白分别用biotin和sulfo标记后，就可以捕获针对这个蛋白特异结合的抗体，从而在MSD上检测到特异信号。
病毒免疫原性的检测：
对于病毒ADA的分析，可以用夹心法或bridge ELISA的方法。两种方法都是用病毒本身作为包被试剂，病毒既可以用产品本身，也可以用商品化的同类病毒颗粒代替。两者在基因上会有微小差异，对于ADA分析一般也是可以接受的。但要注意方法建立不同批次试剂对于方法等效性的评估。阳性对照可以用纯化的抗体，或者阳性血清。
病毒中和抗体的检测：
中和抗体的检测如果可以用携带报告基因的假病毒会使得检测方法更方便。选择细胞系的时候要选择病毒容易感染和复制的细胞系，这样少量的病毒就能产生比较高的信号，从而更少的中和抗体就能抑制这种信号，使得反应体系的灵敏度也比较高。与ADA一样，中和抗体检测很难获得阴性基质进行方法的开发，这时候我们可以不用阴性血清计算统计临界值，而直接用50%抑制率当做临界值来计算滴度。
细胞免疫的检测：
细胞免疫是评价病毒类产品免疫原性的另一个指标。样本为PBMC，通过在特异性抗原肽库的刺激下分泌细胞因子（如IFN-γ）的能力来反应细胞免疫的状态，一般使用ELISPOT检测，也可以通过流式的胞内染色实现。在ELISPOT分析中，一个样本需要做3种处理，阴性对照只加培养基确保背景无污染；阳性对照加入非特异的刺激物（如PMA）用来确保PBMC是合格有活性的；试验组加入特异抗原肽库。如下图，实验组的阳性反应细胞免疫为阳性。ELISPOT的方法建立难点在于选择合适的刺激肽库，另外，在方法建立前能得到真正的阳性PBMC对照也很关键。
综上，相比于小分子疗法和蛋白类药物，病毒产品具有更高的复杂度，为生物分析检测带来新的挑战。
病毒制品的生物分析都需要考虑病毒本身和表达蛋白两种分析物，病毒本身通常需要使用qPCR/ddPCR检测病毒拷贝数，表达蛋白则通常通过LBA的方法进行检测；
病毒类制品需要进行病毒脱落的检测，主要使用qPCR法和细胞法，其中细胞法可以区分活病毒和死病毒，可以进行病毒感染力的测定；
免疫原性的分析更为复杂，需要针对病毒本身和表达产物分别进行总抗体ADA、中和抗体和细胞免疫的分析；
病毒类制品很多是环境病毒，健康人群中普遍存在预存抗体，预存抗体对AAV和溶瘤病毒的影响有区别。
宏韧医药建立了完整的针对各类型病毒类药物的生物分析能力，积累了丰富的项目经验，可以满足病毒类药物临床和非临床的所有生物分析需求。
宏韧医药秉承诚信、规范、质量、效率的服务初心，期待与更多志同道合的伙伴携手合作，为国内外生物医药企业、临床研究中心及药物研发机构等提供质量可靠、合法合规的技术服务，加速创新药和仿制药的研发与上市，为患者提供更好的治疗方案选择。