宏韧医药 | 原位肿瘤-双发光结肠癌原位肿瘤模型

在非临床药效研究中，原位接种肿瘤模型能够更好地模拟肿瘤的生理微环境（如器官特异性基质、血管生成、免疫微环境等），因此在一些特定瘤种的药效评价中具有明显优势。原位结肠/直肠模型（如肠壁内注射）能保留肠道菌群、黏液层和免疫细胞（如肠道驻留T细胞）的影响，这对免疫治疗（如抗CTLA-4）和靶向肿瘤代谢的研究至关重要。

鉴于原位肿瘤模型更接近临床疾病特征，药效评估结果与临床相关性更高，宏韧医药自主构建了荧光素酶（Luciferase，Luc）和红色荧光蛋白（mCherry，mC）双发光表达体系的结肠癌细胞株，并将细胞接种至大、小鼠盲肠系膜三角区（盲肠系膜附着处的肠壁与两层腹膜围成的三角区域定义为“盲肠系膜三角”），建立结肠癌原位肿瘤模型。该模型可对体内肿瘤的生长进行非侵入性监测，以便实时了解细胞的发生、进展、浸润、转移以及相关治疗的抗肿瘤效果。同时，该模型细胞系具备2套发光原理的检测系统，能够适应更多的检测方法，获得更准确稳定的信号，最终输出更加稳定可靠的药效评估结果。

生物发光和荧光检测系统的特征对比

利用慢病毒系统，构建带有Luciferase和mCherry标记的转基因稳转细胞系：HCT-116-Luc-mC。通过酶标仪和流式细胞仪验证Luciferase活性、mCherry强度。

1.1Luciferase活性验证

图1   单克隆细胞Luciferase活性检测

收集细胞（5*10⁴个）进行铺板，采用酶标仪检测化学发光值(RLU)，结果表明HCT-116-Luc-mC细胞的荧光素酶活性显著强于HCT116-WT（野生型）细胞（图1）。

1.2mCherry红色荧光验证

图2：单克隆细胞mCherry表达比例检测

图3：单克隆细胞mCherry荧光强度检测

收集单克隆细胞，选择PE-CF594荧光通道，采用流式细胞仪检测荧光细胞比率以及荧光强度值。结果表明HCT-116-Luc-mC荧光细胞比率高达99.8% 且峰型单一（图2，红色峰），与WT野生型相比HCT-116-Luc-mC的荧光强度显著升高（图3）。

通过手术暴露小鼠盲肠，将HCT-116-Luc-mC细胞（5*10⁶个）接种于盲肠系膜三角（该处的肠壁无浆膜覆盖，接种的结肠癌细胞易于生长，另外盲肠系膜动、静脉和淋巴管在盲肠系膜三角进出肠壁，血供丰富，血液回流于门静脉系统，该部位肿瘤较易侵犯肠系膜血管和淋巴管，使结肠癌发生远处转移，能模拟结肠癌自然转移发生过程），建立小鼠结肠癌原位移植肿瘤模型，利用小动物活体成像系统检测小鼠体内荧光强度变化，同步监测体重变化情况。

图4：小鼠体内Luciferase荧光监测

  图5：小鼠体内mCherry荧光监测

图6：小鼠体重变化曲线

不同时间点的监测结果表明，原位移植小鼠活体Luciferase荧光（图4）、mCherry红色荧光（图5）强度值在接种第20天之后呈现稳定增长，模型建立稳定性较好；小鼠体重变化曲线（图6）显示在接种18-20天之后，小鼠体重受肿瘤影响缓慢下降。

图7：生物光和荧光图像

不同时间点的监测结果代表性图片Luciferase荧光（图7左侧）、mCherry红色荧光（图7右侧）表明随着接种时间的延长荧光强度同步增强，并且后期动物因肿瘤负担加重出现死亡。

该类模型推荐药物类型：VEGF及EGFR抑制剂、免疫检查点抑制剂和肠道菌群调节疗法等。