新药研发中新型递送系统药物 DMPK 研究及其案例分享 | 第十四届中国药理学会药物和化学异物代谢学术会议宏韧报告

近日在上海举办的第十四届中国药理学会药物代谢专业委员会药物和化学异物代谢学术会议，围绕新形势下的新药创制和精准用药涉及的 DMPK 新问题、新认识、新技术、医药成果转化、药物审批法规政策等系列内容开展一系列的报告分享，与会嘉宾进行了深入研讨和交流。

华中科技大学教授、武汉宏韧生物医药股份有限公司 DMPK 部技术总监黄建耿博士受邀出席大会，在【DMPK 与药物新制剂发展】分会场作了 “新药研发中新型递送系统药物 DMPK 研究及其案例分享”的演讲报告！

黄建耿博士，华中科技大学教授、博士生导师；华中科技大学本科、硕博连读；美国内布拉斯加州医学中心、爱荷华大学博士后。具有 16 年以上生物分析、非临床药代动力学研究及临床 PK 统计工作经验。主持国家级、省级等课题 10 余项，完成 300 余个化学创新药与改良型新药 DMPK 研究，中美双报项目 5 项，完成仿制药 BE 研究与创新药 I 期生物分析、数据管理与统计分析、定量药理研究 200 余项。现任国家药品监督管理局食品药品审核查验中心外聘核查专家、中国药理学会药物代谢专业青委会副主任委员、国家药品监督管理局 ICH 协调指导原则《M12 药物相互作用研究》专家组成员等社会职务。已发表学术论文 100 多篇，其中在国际重要学术期刊发表论文 60 余篇；主编或参编《生物药剂学与药物动力学》等教材与专著 4 部；授权发明专利 3 项。

要点概览：

• 新型递送系统非临床与临床 DMPK 研究为阐述其体内 ADME 特征提供数据支持；稳健的生物分析方法至关重要。

• 基于代谢酶与转运体的新型递送系统-药物相互作用，尤其对于新辅料递送系统，有待进一步深入研究。

1、载体设计复杂，工业化困难

• 为了实现给药系统的智能化和多功能化，纳米载体的设计较为复杂，不利于制剂规模化生产与质量控制。

2、体内 PK 过程不清晰

• 目前关于纳米递送系统体内命运的基础性研究不足，关于纳米递送系统与体内生物系统之间相互作用的认识仍非常有限。

研究内容：创新药物或新辅料新型递送系统通常开展体内 PK、组织分布、排泄/物质平衡、代谢产物鉴定、体外稳定性、CYP450 酶表型、CYP450 酶抑制、CYP450 酶诱导、转运体抑制等，其中 CYP450 酶表型、CYP450 酶抑制、CYP450 酶诱导、转运体抑制研究根据新辅料给药频率与周期决定是否开展。改良型递送系统与基因递送系统药物根据药物设计思路通常开展体内 PK 与组织分布研究。

检测方法：

• 化学改良药物：LC-MS/MS

• 基因药物：qPCR，ddPCR，bDNA，活体成像，LBA

• 创新药或新辅料：LC-MS/MS，放射性标记

【宏韧医药项目示例】LTX 脂质微球 (LTX-LM) 生物分析方法关键考虑因素

1、不同形态药物的分离可行性研究

• 总药物浓度包括脂质微球包裹药物浓度、血浆蛋白结合药物浓度和游离药物浓度。

• 包裹和结合药物在一般情况下难以分离。

• 游离药物浓度低，一般存在灵敏度低、吸附性等问题。

2、拟使用的分离方法

（1）固相萃取法 (SPE)

优点：操作简单、高效、成本低

缺点：容易破坏新型制剂的结构，导致药物在处理过程中释放；无法分离包裹药物和游离药物

（2）超滤离心法

优点：分离效果好、操作简便高效、适用范围广

缺点：严重的非特异性吸附

（3）分子排阻法 (SEC)

优点：操作条件较温和，适用温度范围广，不需要有机溶剂，保持分离成分的理化性质。对于高分子物质有很好的分离效果。

缺点：对于分子形状为线形或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，这种方法可能不适用；凝胶柱子成本较高，实验耗时较长。

3、脂质微球药物生物分析稳定性考虑因素

• 样品采集过程（离心力、采集条件）

• 样品处理过程（机械振动、基质处理条件）

• 样品储存过程（室温短期、冻融和长期冷冻稳定性）

LC-MS 方法学验证：血浆（总、包裹、游离）、尿液、粪便

LTX 脂质微球药动学研究：PK 参数分析

本案例获得单剂量与多剂量静脉输注 LTX LM_S 后，总 LTX、包裹态 LTX 和游离 LTX 的平均血浆浓度-时间曲线，计算总 LTX、包裹态 LTX、游离 LTX PK 参数 T_max、C_max、AUC_-1-t、AUC_-1-∞、t_1/2等；通过测定尿液、粪便中药物浓度，评估其排泄动力学特征。此外，采用高分辨质谱对人体内血浆、尿液、粪便中代谢产物进行鉴定。鉴于该研究为保密资料，详细方法学验证与 PK 研究结果未予公开。

欢迎感兴趣的专家老师们莅临宏韧交流讨论。

制备 mPEG_2k-PCL_x 聚合物胶束并进行理化性质（临界胶束浓度、粒径 Zeta 电位等）、形态学表征，考察其体外稳定性。

制备方法：薄膜分散法、溶剂挥发法

用 DLS 测得聚合物胶束的平均粒径在 20～100 nm范围，分布均一，随疏水段分子量的增加而增大，Zeta 电位呈电中性。TEM 观察到的粒径大小变化与 DLS 结果一致。

• 5 种胶束在 CMC 以下未见明显抑制作用或抑制作用较弱，在 CMC 以上随胶束浓度增加抑制作用增强。

• 其中，2 k、3.5 k、5 k 分别在浓度为 0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL 时，可使三种转运体亚型的摄取活性均降至对照组的 50% 以下。

胶束与 hOCT1-3 的定位相似，提示胶束通过与转运体接触发挥抑制作用。

为了进一步探究聚合物胶束和转运体之间发生相互作用的可能性，我们采用共聚焦成像观察了胶束和转运蛋白在细胞内的定位。hOCT1-3 蛋白大部分定位于各过表达 MDCK 细胞的细胞膜，较少定位于细胞质中。负载尼罗红的 mPEG_2k-PCL_2k 胶束孵育 1h 后，细胞显示出强烈的红色荧光。大多数胶束黏附在细胞表面或保留于细胞质中，这与 hOCT1-3 的定位相似，提示胶束通过与转运体接触发挥抑制作用。

1、细胞摄取 mPEG_2k-PCL_x 胶束具有时间依赖性；在相同孵育时间内，细胞对前三种胶束的摄取量明显高于后两种胶束。

2、细胞内的荧光强度与胶束粒径和疏水段长度有关。随着粒径和疏水段长度的增加，细胞内荧光强度逐渐减弱。

3、PCL 链长为 2k 和 3.5k Da（粒径在 20-50 nm）时，可观察到细胞内较大的摄取量。但当 PCL 分子量达 5k（粒径在 50-100 nm）后，细胞内胶束摄取量随疏水段链长增加逐渐减少。其中，亲水/疏水比例越接近，粒径较小的胶束更容易被细胞摄取。

细胞摄取 mPEG_2k-PCL_x 胶束具有时间和能量依赖性，主要经网格蛋白和小窝蛋白介导。其中，亲水/疏水比例越接近，粒径较小的胶束更容易被细胞摄取。

不同浓度 mPEG_2k-PCL_2k 胶束孵育 1h 后胞内荧光强度如图所示。与对照组相比，胶束孵育后三种细胞胞内荧光强度随胶束浓度增加而逐渐增强，提示聚合物胶束对细胞膜电位的影响具有浓度依赖性。

雄性 SD 大鼠

实验组：胶束 (75 mg/kg)

对照组：PBS (n=8)

单剂量胶束组与对照相比无显著性差异，多剂量胶束组在 5min、10min、15min、30min、45min 的血药浓度与对照组相比显著升高，AUC_0-24h、C_max 与对照组相比升高 67.2% 和 15.4%，CL下降 37.4%。此外，V_ss 也下降了 35.6%，t_1/2 和 MRT 无明显变化。

聚合物胶束可通过抑制 OCTs 的转运功能影响二甲双胍肠道吸收、肝脏分布和肾脏排泄。

胶束处理后在 1h 可降低二甲双胍在肝、肾中的水平，5h 和 10h 虽无显著性差异但仍有降低趋势，且多剂量组比单剂量组更为明显。与肝肾中相反，胶束处理后我们发现二甲双胍在小肠水平显著上升。此外，组织/血浆浓度比结果亦提示聚合物胶束影响 OCTs 转运功能从而改变药物分布特性。

mPEG_2k-PCL_x 胶束在 48h 内主要呈现时间依赖性分布，主要在肝脏和肾脏中聚集，且聚集时间超过 24h。

• 1、与对照组相比，二甲双胍降低健康大鼠的血糖水平。无论是单次还是多次给予胶束后，二甲双胍的降糖作用均被减弱。与单用二甲双胍相比，胶束合用组的血糖峰值浓度均显著升高。

• 2、AUC_glucose 结果保持一致，在单剂量给药组中，二甲双胍组 AUC_glucose 与对照组相比显著降低，胶束合用组的 AUC_glucose 也有降低，但与对照组相比无显著性差异。在多剂量给药组中，无论是二甲双胍单独给药组还是胶束合用组的 AUC_glucose，均显著降低；但联合用药组 AUC_glucose 的降低幅度显著弱于单用二甲双胍组。

上述案例研究结果表明，新型递送系统与转运体 OCTs 存在相互作用，影响 OCTs 底物药物体内 PK 与 PD 过程，在新型递送系统研究中有待进一步关注。