基于LC-MS检测平台的多肽类药物生物分析常见问题及解决思路

多肽的生物分析主要包括 PK 药代动力学试验，TK 毒代动力学试验以及抗药抗体 ADA 试验。分析所用到的方法主要包括 LC-MS/MS 和 LBA 配体受体结合试验。在多肽药物的分析方法建立中，正是由于多肽的种种特征，造成了其基于 LC-MS 生物分析的挑战和难点，常见问题及解决思路如下：

1、吸附问题

整体取决于化合物的氨基酸侧链，及其呈现出的电荷状态，多肽往往具有疏水特性，其带点状态则因环境 pH 而异。

---解决思路

1) 增加待测物的溶解度，可加入有机试剂，酸、碱、盐等以改变溶剂环境。

2) 在样品制备过程中，如针对性选择塑料或玻璃管。

3) 加入竞争试剂，比如血浆、BSA 等富蛋白类物质以及表面活性试剂。

2、残留效应

吸附通常会导致残留和峰拖尾。

---解决思路

1) 常见解决小分子残留策略，都值得针对多肽和蛋白进行尝试。较高的自动进样器的温度有助于避免残留（但需结合稳定性考虑，色谱柱分离时的道理与此类似）。

2) 梯度洗脱时清除残留，选择持续注入高有机相不如循环注入高有机相和低有机相洗脱效果好。

3、稳定性问题

主要是生物样品内酶作用下的多肽和蛋白降解，主要发生在氨基酸的R官能团，有氧化、还原、脱酰胺，及空间结构的改变等。

---解决思路

1） 通过控制较低的温度。

2） 加入特异性的酶抑制剂（如不明确对象，可选用抑制剂组合）。

4、提取问题

多肽和蛋白的提取思路需区别于小分子，这是因为传统提取方式多是围绕去蛋白展开，而在此类场景，蛋白和多肽则为目标物。

---解决思路

1）由于目标物分子量较大，蛋白沉淀方式有可能导致共沉淀，需关注沉淀剂的选择。液液萃取，由于多肽和蛋白的“富电”特性，也往往不适用。

2）SPE，注意根据待测物分子粒选择不同孔径的填料，分子量越大，填料孔径越大，离子交换型 SPE 多用于多肽和蛋白的提取。

3）通过衍生化增强保留或增强响应，常见的衍生化位点有 LYS，TRP和CYS，N和C侧也是可选位点。

5、分离问题

多肽和蛋白的分子结构及其分子量，影响了色谱柱的选择。

---解决思路

1）大孔径色谱柱和C4、C8 填料多用于分析分子量大于10000的待测物。另外，C18对于分析肽类和蛋白类物质仍较为常见。

2）TFA作为流动相添加试剂，可改善峰型（酸）和增强保留（离子对试剂），但需要注意对质谱信号的抑制。

6、离子化

多肽和蛋白的离子化问题，主要集中在其带电荷状态的多样性导致的信号降低。

---解决思路

1）加入不同的醇类试剂如DMSO，异丙醇，丙酮等可能对电荷分布有影响。流动相组成，比例，添加剂，甚至喷雾针的直径等都可能影响电荷分布。

2）APCI模式在适当条件下也能用于肽类物质的检测。