间充质干细胞生物分析的关键考虑因素及案例分享 | 第二届大湾区细胞基因治疗发展论坛宏韧医药报告

宏韧医药生物制品生物分析部总监郎士伟博士

1. 制备标准品：细胞产品标准品的 PCR 很少用干细胞本身当标准品，一般是用质粒。质粒的浓度多为质量浓度，需要根据分子量转换为拷贝数。
2. 引物/探针：需要有特异性能区分外源的干细胞和体细胞；提取 DNA 要加入 RNA 酶，并对 DNA 提取的质量做鉴定。这样最后测得浓度结果才能准确。
3. qPCR反应：选择高质量的反应 Mix，TaqMan法进行 PCR 实验。根据标准曲线 qPCR 回算干细胞浓度。
   
   

1. 标准曲线与定量范围：至少 6 个校正标样建立的曲线应满足 R²≥0.98；扩增效率达 90~110%
2. 准确度与精密度：PCR 方法的准确度很多时候不好，常与引物本身的质量和操作的平行性有关，一个好的方法可以做到准确性在 25% 以内
3. LLOQ：灵敏度要求做到 50 copies/μg DNA
4. 提取回收率：基质中加入一定量的细胞进行回收率计算
   
   

1. 检测时先将待测样本与过量的干细胞孵育，让样本中的抗体与干细胞结合并被捕获。
2. 加入荧光素标记检测抗体，如果样本中有抗干细胞的抗体，那么荧光素抗体将进一步结合，从而在细胞表面形成了抗药抗体-荧光素标记抗体的复合物。
3. 通过流式分析细胞表面带有荧光素标记抗体的数值强度，就可以检测原来样本中的抗体存在情况。
   

1. 基因匹配分析：目前，二代测序 (NGS) 已成为 HLA 匹配分析的金标准。
2. 血清抗体分析：即检测受者体内是否有针对供体 HLA 的特异性抗体，这个检测目前应用最广泛的是基于 Luminex 的检测。

1. 传统药物组分单一，而细胞本身复杂度高，一个细胞包含蛋白或核酸等物质达万种，细胞制品的生物分析也更复杂。
2. 干细胞的 PK 和分布有体内示踪和体外检测的方法，qPCR 是在临床和非临床研究中广泛应用的一种检测方法。受限于分析手段和临床取材，组织分布的结果主要来源于非临床研究；临床研究中的 PK 和分布检测相较非临床更加困难。
3. 由于种属差异，干细胞产品在非临床的免疫原性，通常相较临床更为强烈。临床的免疫原性检测需要进行抗药抗体和 HLA 的分析。
4. 干细胞生物标志物检测需要结合干细胞本身特点和临床适应症来选择合适的分析物。