【宏韧医药】ADC类药物结构表征研究及案例分享
宏韧医药
抗体偶联药物（Antibody-drug conjugates，ADC）由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体（Antibody），负责杀死癌细胞的药物有效载荷（Payload），以及连接抗体和有效载荷的连接子（Linker），是近年来肿瘤学发展最快的药物类别之一， ADC 偶联小分子的方式主要包括赖氨酸偶联，半胱氨酸偶联，特定位点偶联等方式（如图1）。
图1：ADC的不同偶联方式
ADC 作用的典型模型假设如下：ADC 药物依靠单抗对肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性达到肿瘤细胞，并通过内吞作用进入细胞，偶联链在细胞内低 PH 值或溶酶体蛋白作用下断裂，释放出细胞毒药物导致肿瘤细胞死亡（如图2）。
图2：ADC的作用机制
因为偶联了有效载荷和连接子，与常规抗体药相比，ADC 药物的结构复杂度和异质性更高。为确保药物安全性和有效性，ADC 的深度表征在其研发过程中至关重要。ADC 药物质量研究与结构表征除需分析单独抗体、小分子药物之外，还应重点表征 ADC 偶联特有的性质，如药物抗体比例 DAR、药物分布、未偶联抗体比例、偶联位点等。关于裸抗、小分子药物和ADC自身的表征内容如下图：
ADC 的全面表征分析应采用适宜的、先进的分析仪器和技术，从理化性质、免疫学特性、生物学活性和杂质等多角度进行全面细致的分析，并结合对裸抗的特性分析充分了解偶联前后的相关特性变化，提供尽可能详尽的信息以反映终产品的质量属性。
涉及到的分析方法包括LC-MS、Edman、SEC-MALS、CD、DSC、Elisa、SEC、HIC、HPLC、CE-SDS、iCIEF、 CZE等，具体内容参照下表：
方法 | 特点 |
液质联用 （LC-MS） | > 质量属性研究的强大工具 > 完整分子/亚基/肽段等多个层面分析 > DAR、偶联位点、未偶联抗体比例等 > ADC产品异质性及工艺一致性评价 |
蛋白测序 | > 研究N-末端氨基酸序列的直接方法 > 可与质谱法N-末端序列分析结果比较 |
SEC-MALS | > 研究表观分子量的有利工具 > 可分析产品分子量分布及寡聚状态 > 可表征蛋白偶联物 |
圆二色谱 | > 研究产品的二级结构和高级结构 |
差示扫描量热 | > 研究热稳定性和热动力学特性 > 可用于制剂筛选 |
动态光散射 | > 研究产品的蛋白粒径及热稳定性 > 可用于制剂筛选 |
酶联免疫吸附实验（ELISA） | > 常用的结合活性检测方法 > 可用于ADC产品结合活性测定、ADC产品浓度测定、总抗体浓度测定、游离药物浓度测定等 > 可用于考察偶联前后抗原结合力差异 |
分子排阻色谱法（SEC） | > 表观分子量大小 > 研究分子大小变异体常用方法 |
疏水色谱法 （HIC） | > 分子量表面相对疏水基团与介质相互作用 > ADC分子基本维持天然构像 > 计算DAR值的有效方法 > 计算未偶联抗体分子比例的有效方法 |
反相色谱法（RPLC） | > 变性分析方法 > 适用于放行 > 肽图分析、小分子残留分析 > Cys-ADC分析汇总有广泛的应用（偶联位置、未偶联抗体比例、DAR等） |
亲水色谱法（HILIC） | > 与RPLC互补的分析方法 > 糖谱分析的常用方法 |
离子交换色谱法（IEC） | > 非变性分析方法 > 最常见的电荷异质性分析方法（完整分子/亚基） > 盐离子梯度/Ph梯度 |
SDS-毛细管电泳（CE-SDS） | > 研究分子大小异质性的高效工具 > 研究药物分布的有效工具 > 偶联后的聚体一级碎片考察 > 与HIC、RP等方法相互补充和印证 |
毛细管等电聚焦电泳（CIEF/iCIEF） | > 研究分子电荷异质性的有效工具 > 可提供产品分子特征性图谱信息 > iCIEF与LC-MS、HIC等结果的相互印证 |
毛细管区带电泳（CZE） | > 平台化、快速的电荷异质性分析方法 > 与分子电荷异质性及流体力学半径均有关 > 可作为IEC以及Icief的补充（完整水平） > 可作为RPLC的补充（肽段水平） |
图3：宏韧结构表征分析服务内容
宏韧医药案例分析
宏韧生物制品质量分析平台可针对“ADC药物的分子量、一级结构和高级结构确证”提供全面的表征分析服务，具体分析案例如下：
1、分子量及DAR值
完整分子量测定：在蛋白质完整分子量层面，确认其分子量、DAR 值分布、定性和定量其组成成分。完整分子量 LC-MS/MS 的测定方法可分为变性质谱和非变性质谱（native MS）方法。
由于半胱氨酸偶联的 ADC 药物分子链间的二硫键被打开，其轻/重链之间仅靠非共价键结合，在传统的变性质谱条件下会解离成抗体片段，无法测定完整蛋白的分子量。采用非变性质谱（Native MS）可以在保持蛋白非共价作用力条件下进行完整分子量的测定。
以下是 DAR 值检测的相关案例。
图 4：ADC 药物 TDM1 分子量检测结果
2、肽图分析
肽图分析是生物药物分析的一项极其重要的关键技术，它提供最全面的生物药表征信息；通过肽图解析，可以确证氨基酸序列、翻译后修饰、二硫键连接形式、NC 末端，药物偶联位点等；本案例使用Trypsin 酶切鉴定 ADC 药物（TDM1）的偶联位点以及二硫键的配对形式。
l ADC 药物的偶联位点分析
图 5：TDM1 小分子药物结构及碎片形式
图 6：ADC 药物 TDM1 偶联位点鉴定结果
l ADC 药物的二硫键分析
图 7：ADC 药物 TDM1 二硫键鉴定结果
3、大小异质体
分子量大小变异（聚合物、颗粒、碎片）可以直接影响蛋白质治疗方法的有效性或安全性。聚集是蛋白质物理降解的最常见的途径。由于药物/连接子的存在，它们在偶联位点的周围具有更多的疏水性，导致 ADC 比母体抗体更容易聚集。
常用的大小异质体分析方法包括：分子排阻色谱法（SEC-HPLC)、非还原型和还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳（CE-SDS）、尺寸排阻色谱与多角度光散射联用（SEC-MALS）和分析型超速离心（AUC）等多种方法对ADC的分子大小变异体（即聚合物和片段）进行适当鉴定。
MALS 技术是基于蛋白的分子量与光散射的强度直接相关性来测定蛋白绝对分子量的技术，无需使用标准蛋白，不依赖于洗脱体积。通过SEC（Size Exclusion Chromatography体积排阻色谱）分离后的各组分进入多角光散射检测器，激光照射到分析物时会发生光的散射，MALS 通过多个角度同时测定散射光的强度，散射光强度正比于摩尔质量、浓度、折光指数增量的平方，可以直接计算出分析物的绝对分子量分布以及聚集体的聚合度。
图 8：ADC 药物 TDM1 SEC-MALS 检测结果
4、电荷异质体
蛋白质治疗的电荷异质是重要的质量特性，对稳定性和生物活性具有潜在的影响。对于单克隆抗体，通常采用毛细管区带电泳（CZE）、离子交换高效液相色谱（IEX-HPLC）、毛细管等电聚焦电泳（CIEF）或成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）等适当方法测定电荷异质体。这些方法对ADC分析的适用性取决于药物-连接体的特性（尤其是电荷）以及结合位点的选择（如赖氨酸、链间巯基、碳水化合物等）。
目前常用成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）来表征 ADC 等具有电荷较复杂样品的电荷异质体和等电点。
图9：ADC 药物 TDM1 iCIEF检测结果
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